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熒光顯微鏡常用的激發光源 顯微鏡光源

更新時間:2022-10-10   點擊次數:2625次

熒光顯微鏡常用的激發光源

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在收到紫光外或者藍光激發時,發射綠色熒光,可在各種異源細胞,如細菌/昆蟲以及植物細胞中表達,在植物研究中,通常需要各種顯微鏡來確定該基因是否表達,偶爾也會因為植物自發熒光導致假陽性的誤判。熒光顯微鏡常用的激發光源甚至肉眼就可以觀察到,且靈敏度高,對于單細胞水平的表達也可識別。

綠色熒光蛋白在紫外線的激發下發光

GFP是從水母分離出的一種天然熒光蛋白,分子量約27000。為一個由238個氨基酸殘基組成的單鏈多肽,其熒光發射峰在509nm,zui大激發波長為395 nm,并在470 nm處有一肩峰,GFP的化學性質相當穩定,其變性需在90℃或pH<4.0或ph>12.0的條件下用6mol/L鹽酸胍處理。GFP的熒光發光有兩個明顯的吸收帶,對應于GFP的兩種不同構象的基態A和B。基態A對應于395nm的吸收峰,基態B對應于475nm的吸收峰,基態A占優勢,基態B的分子數量約是基態A的1/6,兩種基態間能緩慢地轉換,但激發態A 之間的轉換很快且發生了質子轉移,A 快速高效地衰變至另一激發態,應該存在一個中間過度態I,質子轉移使A 轉變成I ,I 回遷到基態I時產生發射峰504nm的熒光,構象改變使I 轉變成B ,由B到B發射熒光而不發生質子轉移。目前,對于GFP的作用機理較為認同的僅僅是:GFP是生物發光過程中的能量受體,并且是zui終的發光體,不同的生物發光機制各不相同,不同的突變體發光機制也有很大差異。

圖一:綠色熒光蛋白在LUYOR-3415RG激發光源的激發下發光

除此之外,LUYOR-3415實驗室燈還可以用做以下用途:

1、 野外、實驗室原位測定RFP(紅色熒光蛋白)。

2、 應用于轉基因作物研究。

3、 區別可遺傳性改良生物體和不可遺傳的改良生物體。

4、 用于基因表達的研究。

5、 用于Rhodamine(紅色熒光染料)、葉綠素、熒光素的研究。

為什么藍光和紫外線激發光源能激發GFP發出綠色熒光?

綠光蛋白GFP吸收的光譜峰值為395nm(紫外),并有一個峰值為470nm的副吸收峰(藍光);雖然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于長波能量低,細胞忍受能力強,更適合活體檢測,因此通常多使用藍光波段光源(多為488nm)。GFP發射光譜zui大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側峰(Shouder)。

圖二:LUYOR-3280UV紫外激發光源

為什么藍光和紫外線激發光源能激發GFP發出綠色熒光?

熒光蛋白GFP發光原理

熒光蛋白發光類型屬于斯托克斯位移型,其基本原理是生色團在較高能量的光子照射下發生構象的改變,從而導致分子能級變化,從高能級的構象躍遷向低能級時發出較低能量的光子。生色團在發光過程中主要有兩種化學過程。一是質子轉移,即質子化和去質子化,二是分子構象的改變。生色團主要有三種構象:A型、B型以 及中間過渡態Z 型。在分子構象變化的同 時還伴隨著氫鍵的生成和斷裂,以及電荷的傳遞去質子化和質子化的分子構象不同, 對應的分子能級也不同,從而其發射光譜中有兩個特征峰,代表兩種躍遷過程。質子化構象生色基團通過Tyr66 的脫質子狀和質子化狀態(酚羥基)的轉換決定熒光發射。由于酚的激發態酸性遠大于其基態, 故僅脫質子態的結構發射熒光。這個過程是十分迅速的,因此熒光蛋白發射的是熒光而不是磷光,需要激發光源持續存在才可連續發光。但是其極快的激發響應使得熒光蛋白適合作為高靈敏度生物探針以及生物成像材料。

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圖三:LUYOR-3415RG激發光源照射煙草葉片的GFP發光

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